Antikörper-Biosensor für die Atemanalytik (2010-2015)

Hoch sensitive Sensoren für den Nachweis kleinster Konzentrationen (ppb oder pg/ml) von unterschiedlichen Analyten sind im Bereich der Atemanalytik unabdingbar. Im Rahmen dieses Projekts wurde daher ein Biosensor zur potenziellen Detektion von Biomarkern im Atemkondensat entwickelt. Zum Nachweis von niedrigkonzentrierten Zytokinen wurde ein hochdichtes, miniaturisiertes Antikörper-Microarray entwickelt. Das Array besteht aus Anti-Zytokin-Antikörpern (gegen die Zytokine TNFα (tumor necrosis factor alpha) und IL-6 (Interleukin 6) als Beispiele für Asthma-Biomarker) auf einem Substrat, das fluoreszenzbasiert ausgelesen wird.

Materialsynthese: Herstellung eines miniaturisierten Antikörper-Microarrays

Die Auswahl des geeigneten Trägers zur kovalenten Immobilisierung ausgewählter Antikörper war von besonderer Wichtigkeit. Drei unterschiedliche Substrate wurden für die Immobilisierung getestet. Es zeigte sich, dass 3D-Hydrogele, die mit N-hydroxysuccidinimidyl-(NHS) funktionalisiert sind, die besten Immobilisierungsergebnisse aufweisen. Das kontaktfreie Drucken (Nanoplotting) der Antikörper führte dabei zu deutlich kleineren homogenen Strukturen und höheren Signaldichten als vergleichbare Amin- oder Epoxy-funktionalisierte Substrate. Nach Optimierung von Plot-Parametern und -Geometrie sowie der Puffermedien konnten mit einer Dichte ~100 Spots/mm² dichtere Assays (als kommerziell normalerweise erhältlich) erzielt werden.

Materialcharakterisierung : Charakterisierung der Antikörper-Assays

Die Substrate wurden mittels XPS- und Kontaktwinkelmessungen charakterisiert und zeigten die erwarteten Ergebnisse. Zur Messung der Druckergebnisse wurden kommerziell verfügbare Fluoreszenzlabel ausgewählt und diese mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Insbesondere Allophycocyanin (APC) und Phycoerythrin (PE) erwiesen sich als sehr geeignet, um als Detektionsmarker eingesetzt werden zu können.

Funktionsprüfung : Zytokin-Nachweis in einem direkten Assay und einem Sandwich-Assay

Zur Detektion der Zytokine wurden die entwickelten Assays entweder als direktes Assay oder als Sandwich-Assay genutzt. Für ersteres wurde der Analyt mit dem Fluoreszenz-Label versehen, auf das Assay gegeben und die Anbindung an den vorimmobilisierten unmarkierten Antikörper mit dem Fluoreszenz-Mikroskop detektiert. Für die Sandwich-Detektion wurde das Zytokin unmarkiert auf das Assay gegeben und die Anbindung mit einem zweiten, markierten Antikörper detektiert. Mit dem Array konnten dabei Zytokine im Bereich von <1 pg/Spot nachgewiesen werden, wobei die zusätzliche Machbarkeit einer weiteren enzymbasierten Signalvervielfältigung gezeigt wurde.

Struktur-Funktions-Beziehung: „Ambient Analyte Theory von Roger Ekins“

Im Projekt wurden die Mengen immobilisierter Biomoleküle abgeschätzt und im Rahmen der Ambient Analyte Theory von Roger Ekins diskutiert. Es zeigte sich, dass eine Verkleinerung der Spots zu einer verbesserten Detektion (wie in der Theorie beschrieben) führte. Nichtsdestotrotz ist das Auftreten von unspezifischer Bindung des Analyten limitierend für die Sensitivität des Assay. Lösbar wäre dieses Problem am einfachsten, wenn der Analyt ortsnah auf dem Detektionsspot appliziert werden könnte (mikrofluidisch oder Spot-in-Spot Drucken).


Kooperationen

Das Projekt wurde In Zusammenarbeit mit dem Materials Science Laboratory der der Sony Deutschland GmbH (Leiterin Dr. G Nelles) durchgeführt.

Finanzierung

Die Finanzierung des Projekts erfolgte über die  Sony Deutschland GmbH.

Ausgewählte Publikationen

  1. Hospach I,  Hulko M, Joseph Y, Krasteva N,  Nelles G Raible I,  and Ulmer J; A sensor for detecting an analyte, Patent, Application no.  EP 08017511
  2. I. Hospach, Y. Joseph, G. Nelles, N. Krasteva Protein microarray for the detection of cytokines in body fluids”,Vortrag 2nd International Conference on Bio-Sensing Technology 2011, 10-12 October 2011, Amsterdam, The Netherlands
  3. Hospach, Y. Joseph, M. Mai, N. Krasteva, G. Nelles; Fabrication of  Homogenous High-Density Antibody Microarrays for Cytokine Detection; Microarrays 3 (2014) 282-301